SUELOS ECUATORIALES 48 (1 y 2): 32-40 ISSN 0562-5351
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DESARROLLO DE UN PROTOCOLO PARA LA OBTENCION DE MICROORGANISMOS ENDOGENOS
BIOAUMENTADOS QUE ACELEREN EL PROCESO DE COMPOSTAJE, DE LA INDUSTRIA DE PALMA
DE ACEITE.
Ana cristina Carrillo
1
, Luisa Fernanda Daza
2
, Yenni Carolina Barraza
3
1,2,3
SENA
criscarrilloana
@ho
tmail.com
Palabras
Claves:
Actinomicetos
,raquis,
biotecnología,
celulolíticos,
autóctonos
RESUMEN
El compostaje en la industria de la palma de aceite es de suma importancia debido a la gran cantidad de residuos sólidos
generados en su explotación ya que solo es utilizado el 9% del total de la materia prima, situación que exige la búsqueda
de soluciones biotecnológicas que permitan el aprovechamiento de estos volúmenes de residuos, que generan grandes
costos en la movilización y problemas medioambientales. Una de las características de estos residuos es que son ricos
en celulosa siendo uno de los principales el raquis, el problema en la generación de este tipo de compost es el tiempo de
degradación y que al final del proceso quedan fibras enteras o parcialmente degradadas; en este sentido es importante
promover el crecimiento de microorganismos nativos y eficientes como los actinomicetos los cuales metabolizan muy bien
este tipo de compuestos. Se desarrollo un protocolo para la obtención de microorganismos endógenos bioaumentados
que aceleren el proceso de compostaje de los residuos sólidos, de la industria de la palma de aceite (Elaeis guineensis).
Logrando aislar 11 cepas de actinomicetos celulolíticos Las especies de actinomicetos que más prevalencia tuvieron en
las muestras estudiadas fueron especies del genero Streptomyces sp., Thermomonospora sp y Nocardia sp., seguida de
otras especies en menor proporción. Se evaluó la actividad endoglucanasa, exoglucanasa y b-glucosidasa de 11 cepas
de actinomicetos celulolíticos. Entre éstas la cepa de Streptomyces sp. M3 Y M 7mostraron los mayores niveles de
actividad.
DEVELOPMENT OF A PROTOCOL FOR THE OBTAINING OF BIOAUMENTED ENDOGENOUS
MICROORGANISMS THAT ACCELERATE THE PROCESS OF COMPOSTING, OF THE INDUSTRY OF
PALM OF OIL.
Key words:
Actinomycetes,
rachis,
biotechnology,
cellulolytics,
autochthonous.
SUELOS
ECUATORIALES
48 (1 y 2): 32-40
ISSN 0562-5351
ABSTRACT
Composting in the oil palm industry is of great importance due to the large amount of solid waste generated in its
exploitation since only 9% of the total raw material is used, a situation that requires the search for biotechnological solutions
that allow the use of these volumes of waste, which generate large costs in the mobilization and environmental problems.
One of the characteristics of these residues is that they are rich in cellulose, one of the main ones being the rachis, the
problem in the generation of this type of compost is the time of degradation and that at the end of the process remain whole
or partially degraded fibers; In this sense it is important to promote the growth of native and efficient microorganisms such
as actinomycetes which metabolize this type of compounds very well. A protocol was developed to obtain bioaugmented
endogenous microorganisms that accelerate the composting process of solid waste, from the oil palm industry (Elaeis
guineensis). Achieving isolating 11 strains of actinomycetes cellulolytics The species of actinomycetes that had the highest
prevalence in the studied samples were species of the genus Streptomyces sp., Thermomonospora sp and Nocardia sp.,
Followed by other species in smaller proportion. The endoglucanase, exoglucanase and b-glucosidase activity of 11
cellulolytic actinomycete strains was evaluated. Among these, the strain of Streptomyces sp. M3 and M 7 showed the
highest levels of activity.
Rec.: 04.05.2018
Acep.: 07.06.2018
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INTRODUCCIÓN
Colombia es el quinto país productor de aceite crudo
de palma en el mundo, con una producción
acumulada de 753.000 t en 2010 (Fedepalma,
2011). El proceso de elaboración de aceite de palma
deja como principales subproductos los racimos
vacíos (RV), la fibra de fruto (FF) y los efluentes. Los
racimos de fruto fresco (RFF), provenientes del
campo, son procesados en la planta de beneficio,
donde se esterilizan y se desfrutan para extraer el
aceite, dejando así 20 kg de RV y 14 kg de FF por
cada 100 kg de RFF que ingresan al proceso (García
et ál., 2010). La esterilización de los RFF, la
extracción del aceite y sus subsecuentes pasos de
decantación y purificación, así como el
procesamiento de la almendra del fruto, de la cual se
extrae el aceite de palmiste, generan entre 65 y 85
kg de efluentes por cada 100 kg de RFF. Algunas
empresas palmicultoras en Colombia han defendido
el uso del proceso de compostaje como una forma
viable de retorno de nutrientes al agroecosistema,
así como una solución de disposición de
subproductos. No obstante, son muchos los
detractores del uso de este proceso, resaltando las
desventajas que éste pueda tener.(Boletín técnico
de cenipalma 2012).sin embargo la preparación del
compost con raquis ofrece una muy buena
alternativa para la cobertura del suelo (Daza,
Maestre, 2004).Según trabajos realizados por Faure
(1991) y Vargas-García (2007), se ha probado la
producción de inoculantes a partir de un cultivo
formado por una mezcla de microorganismos
endógenos seleccionados de pilas de compostaje y,
por lo tanto, mejor adaptados a esas condiciones. El
inoculo constituyó un agregado significativo en
número para producir una bioaumentación y la
reducción del tiempo de formación y maduración del
compost (De Carlo et al., 2001). En investigación
realizada por Usuga Osorio (2008), los resultados
permitieron reforzar la idea de utilizar inóculos
nativos en los procesos de fertilización y
acumulación de biomasa en la planta de banano,
seleccionando una mezcla de microorganismos
autóctonos donde la planta de interés es cultivada.
Para que las especies existentes en la mezcla del
inoculo expresen su potencial deben combinarse el
manejo agronómico con la aplicación de abonos
orgánicos. El manejo racional y sustentable de la
fertilidad de los suelos busca indispensablemente
aumentar la eficiencia de su utilización la que no
depende de mayores de tasas de aplicación de
fertilizantes, si no de fomentar procesos de reciclaje
y eficiencia en la absorción de nutrientes, donde la
integración de la inoculación a los sistemas
agronómicos, serian una forma de aprovechamiento
de su funcionalidad.
El objetivo de esta investigación, es desarrollar un
protocolo para la obtención de microorganismos
endógenos bioaumentados que aceleren el proceso
de compostaje de los residuos sólidos, de la
industria de la palma de aceite (Elaeis guireensis), lo
cual se realizó a través de la caracterización
morfológica, que es un procedimiento diferencial de
la identificación de microorganismos, por el cual se
reúnen datos acerca de una especie y se comparan
con los resultados obtenidos por diferentes técnicas.
Las referencias se agrupan y forman un concepto
generalizado que preliminarmente pueden guiar el
reconocimiento de la especie con la que se trabaja.
MATERIALES Y MÉTODOS
1. Toma de muestras
El estudio se llevó a cabo en el laboratorio de
agroindustria del centro Biotecnológico del caribe,
ubicado en la ciudad de Valledupar. Las muestras
de raquis procedían de la Hacienda las Flores (N
10°03.51.9 ubicada en el municipio de Agustín
Codazzi, Cesar. Para la obtención de los
microrganismos autóctonos se realizó de manera
previa una caracterización de las pilas de
compostaje de raquis en las etapas (termofilicas y
de maduración) de las cuales se tomaron un total de
50 muestras representativas para su posterior
análisis físico-químicos y microbiológicos como lo
sugiere la Norma Técnica Colombiana NTC 5167.
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Tabla1. Caracterización de las pilas de compostajes muestreadas.
RECETA COMPOSTAJE
RAQUIS
0,70%
TONSIL
0,05%
FIBRA
0,05%
T. PALMIS
0,05%
CACHAZA
0,05%
LODOS T
0,05%
R. BIODIES
0,03%
CENIZAS
0,03%
Se seleccionaron 30 pilas de compostaje, tomando 10 submuestras para formar una compuesta de 50gr por
cada muestra, a una profundidad de 15 cm cada una.
Aislamiento primario
Se aislaron 11 cepas de actinomicetos celulíticos de
la etapa termofilica y de maduración, mediante un
aislamiento primario en agar czapek-Dox más
nistatina por la técnica de diluciones seriadas
dilución hasta 10
-8
los cultivos fueron incubados a
37
0
C por diez dias.
Aislamiento secundario
Luego del tiempo de incubación se realizó una
segunda siembra en agar zapec dox más nistatina
para purificar las cepas de actinomicetos presentes
en el aislamiento primario, la identificación se realizó
mediante caracterización macroscópica y
microscópica de las colonias (Fig.1) y las pruebas
bioquímicas utilizando los kits de identificación BBL
Crystal para gram positivos y gram negativos para
ampliar la variedad de azucares en la conformación
de los perfiles metabólicos de cada una de las
especies escogidas
Posteriormente se realizó la crioconservación de las
cepas aisladas en crioviales a -20°c. Se efectuaron
pruebas de evaluación enzimática cualitativa y
cuantitativamente en medios de cultivos específicos
a cada uno de los microorganismos aislados.
Se optimizo un medio de cultivo a partir de residuos
de raquis puro en diferentes concentraciones, con la
finalidad de evaluar el comportamiento de las cepas
en este medio.
Extracción de ADN
En función del tipo de análisis a realizar y de la
necesidad de obtener un ADN puro, se aplicaron
distintos protocolos de extracción hasta conseguir el
más apropiado, logrando estandarizar un protocolo
de extracción de ADN con fenol-cloroformo, la
cuantificación se realizo mediante microdrop para
determinar la pureza usando como indicador la
relación de absorbancias a las longitudes de onda
de 260nm y 280nm y Electroforesis en gel de
agarosa, para determinar la integridad y el tamaño
de la molécula de ADN y/o productos de
amplificación.
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Tabla2. Protocolo de mejor rendimiento en la extracción de ADN de los morfotipos ensayados.
Protocolo estandarizado de extracción de ADN para actinomicetos
Tomar del medio con crecimiento y llevar a un eppendorf
Congelar -20º por 25`
Llevar a baño maría, 85º 15`
Repetir el ciclo de congelación- descongelación
Centrifugación a 10.000 rpm 10`
Agregar 5ml de las colonias para maceración.
Macerar las colonias en un mortero con 600 µl de Buffer de Lisis celular.
Recuperar 2ml del macerado
Agregar en 500 µl de Tampón TE
Agregar 10 µl de lisozima 0,66 mg/ml
Incubar a 37º 30`
Agregar 20 µl de Proteinasa K
20 µl de SDS 10%
Vorterizar
Incubar a 55º 30`
Atemperar
Agregar una proporción de 1:1 de fenol cloroformo
550 µl :550 µl
Centrifugar a 10.000rpm 5`
Recuperar sobrenadante
Agregar etanol al 90% 600 µl
Congelar -20º 30`
Centrifugar 10.000 rpm 10`
Descartar sobrenadante sobre papel Absorbente
Lavar 2 veces sedimento con etanol al 70%
300 µl y repetir proceso de centrifugación y descarte cada lavado.
Descartar sedimento
Agregar 50 µl buffer de rehidratación de DNA
Temperatura ambiente 24 horas, refrigerar en nevera de -20º.
Próximamente se realizara la reacción en cadena de la polimerasa PCR, para obtener la identificación
molecular de estas e implementar el protocolo de bioaumentacion para la aplicación de estos
microorganismos en el compost de raquis de palma para que aceleren su proceso de degradación y así
adquirir un compost de óptima calidad.
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RESULTADOS Y DISCUCIÓN
Características de las pilas de raquis
En la tabla 1 se observa la composicion de Las
pilas muestreadas con los mayores contenidos, en
un 80% de raquis de palma, un porcentaje de
Tonsil proveniente de la refinacion del aceite, un
porcentaje de cachasa y ceniza y otros
componentes que se usan en la planta de
extraccion.
Grafica 1. Caracterización de las pilas de compostaje de raquis de palma.
Identificación de actinomicetos:
De acuerdo a las características Macroscópicas
de Actinomicetos, referenciadas en el libro The
Prokaryotes A Handbook on the Biology of
Bacteria Vol.3, el cual describe los Actinomicetos
como colonias de crecimiento lento, de aspecto
ceroso, polvoroso, adheridas al agar (figura 1a y
b), de colores variantes entre blanco grisáceo,
crema (figura 1 a), colores tierra y negro, se
identifican un total de 11 posibles cepas de
Actinomicetos.
RMP
0
200
400
600
800
1000
1200
RAQUIS TONSIL FIBRA T. CACHA LODOS R. CENIZA
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M3
A
b
M7
C
d
M8
e
f
f
Figura 1.Características Macroscópicas a,c,e. Microscópicas b,d,f de algunos Actinomicetos del
compostaje de raquis de palma. M3. Streptomyces ; M7 Nocardia; M8 Thermonospora .Fuente autores.
De las cepas seleccionadas se realizaron repiques
en agar avena más nistatina para evaluarlas
microscópicamente teniendo en cuenta las
recomendaciones realizadas en Bergey’s Manual
ofSystematic Bacteriology [3] considerando su
morfología con estructuras miceliares (figura b, d,f)
esto con el fin de establecer cuáles de estas cepas
son en verdad Actinomicetos. De las 15 cepas
consideradas posibles Actinomicetos 4 fueron
descartadas, ya que macroscópicamente no eran
colonias secas de aspecto seroso, en su mayoría
presentaron un aspecto cremoso; adicionalmente,
microscópicamente no presentaban estructuras
miceliares. Así, se determinó que 11 de las 15 cepas
aisladas en Agar Avena podían ser posibles colonias
de Actinomicetos.
Posteriormente se realizaron pruebas de evaluación
enzimática cualitativa y cuantitativamente en medios
de cultivos a base de raquis a cada uno de los
microorganismos aislados, se observaron halos de
degradación en todos los medios, lo cual nos
permite suponer que estos microorganismos son un
buen degradador raquis de la palma.
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Figura 2.Evaluacion celulolítica cualitativa y cuantitativa de las cepas M 11, M1 Y m7
En la optimización del cultivo a partir residuos de
raquis puro en diferentes concentraciones, se
observó como resultado una mejor expresión y
velocidad de crecimiento de las cepas M3 y M7 en
la mayor concentración de raquis al 5 % tanto en
medio sólido como medio líquido.
Figura3.Evaluacion de medio de cultivo de raquis de palma en diferentes concentraciones.
Los resultados de la microscópica muestran que le
mayor porcentaje de las cepas M 1, M2, M3, M4, M5,
M6 se pueden identificar con claridad como
pertenecientes al género de Streptomyces, el cual
presenta características como la no fragmentación
del micelio de sustrato, la fragmentación del micelio
aéreo y la formación de cadenas de conidias o
bacilos en disposición de espiral. El resto de las
cepas muestran las características microscópicas
de actinomicetos pertenecientes a los géneros de
Nocardia M7 y Thermonospora M8; que agrupa
Actinomicetes termofilicos y celulolíticos.
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Grafica 2. Resultados prueba de peso seco, cuantificación de la biomasa.
En la gráfica anterior se presentan los resultados
obtenidos del análisis de superficie de respuesta
para producción de biomasa a partir de raquis. Las
variables analizadas pH, concentración de raquis
vs peso seco arrojan una curva donde la
concentración del raquis resulta como la variable
predominante (VALOR P DEL 99,2%) mientras que
el pH presenta altas producciones de peso seco a
pH altos y bajos (pH 8,4 y 7,0 respectivamente).Los
valores de pH cercanos a 7,8 resultan pocos
beneficiosos para el crecimiento del microorganismo
Streptomyces sp. Los valores óptimos arrojados del
análisis superficie de respuesta son los pH 8,2
concentración de raquis al 5,0 %, podemos decir
que la preparación previa del raquis contribuye a un
aumento de la acción enzimática.
Extracción de ADN
Los Actinomicetos filamentosos forman
agrupaciones de hifas fuertemente unidas que es
necesario disgregar para conseguir rendimientos
adecuados en la extracción de DNA. Además,
muchas especies crecen fuertemente adheridas al
agar debido al micelio de sustrato que producen [3].
En este caso las cepas cultivadas en medio líquido
de raquis se sometieron a dos ciclos de congelación
y calentamiento adicionalmente se centrifuga y se
macera el resultante con el buffer de lisis celular todo
esto con el fin de ayudar a romper a la pared de
estos microrganismo lo cual es de suma importancia
para lograr obtener el ADN de los actinos a estudiar.
La electroforesis muestra la presencia de bandas de
ADN (Figura 4).
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Figura 4.Electroforesis en gel de agarosa al 1%. de los aislados M1, M2, M3, M6, M8,MA, M10, MB Y
M1dif.
Todas las diluciones mostraron la presencia de una
banda de amplificación correspondiente al fragmento del
gen, de 345 pb. Esto indica que las modificaciones
introducidas al protocolo de extracción de
DNA, resultaron exitosas, logrando obtenerse DNA en
condiciones de pureza adecuadas (libre de inhibidores)
como para permitir la reacción de amplificación por PCR.
CONCLUSIONES
El aislamiento de actinomicetos a partir de muestras
compost de raquis de palma presenta problemas
debido a la microbiota de lento crecimiento. Los
métodos de multiplicación a partir de un medio de
cultivo natural hecho a base de raquis de palma el
cual sirve como base para la extracción del ADN del
mismo utilizado en este trabajo, facilitan la
obtención de un ADN puro. Sin embargo la
utilización de los métodos tradicionales combinados
con un kit comercial de extracción (Promega) en
muestras procedentes de compost buscan validar la
extracción para los géneros más importantes con
propiedades de degradación de celulosa.
La bibliografía consultada existen pocas referencias
sobre aislamiento e identificación de actinomicetos de
compost de raquis de palma, por lo tanto con este tipo de
medios de cultivo se podría aumentar el aislamiento de
Streptomyces, Thermonospora y Nocardia en compost
de raquis para su posterior identificación molecular.
REFERENCIAS
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Actinomicetos e Interacciones de estas Rizobacterias
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Bandas de ADN